Fluo-3AM (Synonyms: Fluo-3 Acetoxymethyl ester) |
Katalog-Nr.GC33437
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Fluo-3AM (Fluo-3-pentaacetoxymethyl ester) ist eine der am häufigsten verwendeten Fluoreszenzsonden zur Bestimmung der intrazellulären Calciumionen-Konzentration.
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Cas No.: 121714-22-5
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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Fluo-3AM (Fluo-3-pentaacetoxymethyl ester) ist eine der am häufigsten verwendeten Fluoreszenzsonden zur Bestimmung der intrazellulären Calciumionen-Konzentration. Nach dem Eindringen in die Zelle und dem Durchdringen der Zellmembran wird es durch zelluläre Esterasen zu Fluo-3 gespalten und verbleibt so in der Zelle. Als freier Ligand ist Fluo-3 nahezu nicht-fluoreszierend, zeigt aber nach Bindung an intrazelluläre Calciumionen eine starke Fluoreszenz mit einer maximalen Anregungswellenlänge von 506 nm und einer maximalen Emissionswellenlänge von 526 nm. Für die praktische Anwendung wird eine Anregungswellenlänge von etwa 488 nm und eine Emissionswellenlänge von 525-530 nm empfohlen. Veränderungen der intrazellulären Calcium-Konzentration lassen sich mittels Laser-Konfokalmikroskop oder Durchfluss-Zytometrie detektieren[1-4].
References:
[1]. Loughrey CM, MacEachern KE, et,al. Measurement of the dissociation constant of Fluo-3 for Ca2+ in isolated rabbit cardiomyocytes using Ca2+ wave characteristics. Cell Calcium. 2003 Jul;34(1):1-9. doi: 10.1016/s0143-4160(03)00012-5. PMID: 12767887.
[2]. Ji S, Li S, Zhao X, et,al.Protective role of phenylethanoid glycosides, Torenoside B and Savatiside A, in Alzheimer's disease. Exp Ther Med. 2019 May;17(5):3755-3767. doi: 10.3892/etm.2019.7355. Epub 2019 Mar 7. PMID: 30988761; PMCID: PMC6447766.
[3]. Williams PDE, Verma S, et,al.Adapting techniques for calcium imaging in muscles of adult Brugia malayi. Invert Neurosci. 2020 Aug 16;20(3):12. doi: 10.1007/s10158-020-00247-1. PMID: 32803437; PMCID: PMC7891862.
[4]. Williams PDE, Kashyap SS, et,al.Diethylcarbamazine, TRP channels and Ca2+ signaling in cells of the Ascaris intestine. Sci Rep. 2022 Dec 9;12(1):21317. doi: 10.1038/s41598-022-25648-7. PMID: 36494409; PMCID: PMC9734116.
Dieser Plan dient nur als Richtlinie. Passen Sie bitte ihn an Ihre spezifischen Bedürfnisse an.
1. Färbelösung herstellen
(1) Stammlösung herstellen: Bereiten Sie eine AM-Ester-Stammlösung mit einer Konzentration von 1-10 mM in hochreinem, wasserfreiem DMSO zu.
Hinweis:
① Teilen Sie die nicht benötigte Stammlösung in Aliquots auf und lagern Sie sie im Dunkeln bei -20°C oder -80°C, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.
② Acetoxymethylester(AM) ist feuchtigkeitsanfällig. Lassen Sie die Lösung nach der Entnahme aus dem Kühlschrank in einer trockenen Umgebung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie öffnen. Zentrifugieren Sie die Lösung vor dem Öffnen kurz, damit sich das Pulver am Boden des Röhrchens absetzt.
(2) Arbeitslösung herstellen: Verdünnen Sie die Stammlösung mit einem geeigneten Puffer(z.B. serum- und phenolrot-freiem Kulturmedium oder PBS) zu einer Arbeitslösung mit einer Konzentration von 1-10 μM.
Hinweis:
① Bei der Herstellung der Arbeitslösung für die AM-Ester-Färbung kann es erforderlich sein, der Stammlösung eine geeignete Menge 20%iger Pluronic F-127-Lösung zuzusetzen, um die Wasserlöslichkeit der AM-Sonde zu verbessern.
② Pluronic F-127 kann die Aggregation der AM-Sonde in Lösung verhindern und deren Aufnahme in die Zellen verbessern. Da Pluronic F-127 jedoch die Stabilität der AM-Sonde beeinträchtigen kann, wird die Zugabe nur bei der Herstellung der Arbeitslösung empfohlen. Es wird nicht empfohlen, die Stammlösung für die Langzeitlagerung hinzuzufügen.
③ Herstellung der 20%igen(w/v) Pluronic F-127-Stammlösung: 100 mg Pluronic F-127-Pulver(Cat. No.: GB30090) abwiegen, 500 μl DMSO zugeben, 20-30 Minuten bei 40-50℃ erhitzen und bei Raumtemperatur lagern. Falls Kristalle ausfallen, können diese durch erneutes Erhitzen wieder aufgelöst werden, ohne die Anwendung zu beeinträchtigen.
④ (Optional) GLPBIO stellt gelöstes Pluronic F-127 (20%ige Lösung in DMSO) zur Verfügung(Produktnummer: GB30091).
⑤ Geben Sie ein gleiches Volumen der 20%igen Pluronic F-127-Lösung zur Stammlösung hinzu, sodass die endgültige Arbeitskonzentration von Pluronic F-127 etwa 0.02% ist.
⑥ Passen Sie die Konzentration der Arbeitslösung den jeweiligen Anforderungen an und bereiten Sie sie jetzt vor, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.
2. Färbung der Zellsuspension
(1) Zellsuspension: Zentrifugieren Sie die Zellen 3-5 Minuten bei 4°C und 1000 g. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS oder einem anderen Puffer(jewels 5 Minuten).
(2) Adhärente Zellen: Zweimal mit PBS oder anderen Puffern waschen, Trypsin zur Digestion zugeben und nach Abschluss der Digestion 3-5 Minuten bei 1000 g zentrifugieren.
(3) Farbstofflösung zugeben, um die Zellen zu resuspendieren, und 20 Minuten bis 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur oder darunter inkubieren. Die optimale Inkubationszeit variiert je nach Zelltyp. Bitte ermitteln Sie dies entsprechend Ihren spezifischen experimentellen Anforderungen.
Hinweis:
① Die empfohlene Arbeitskonzentration von AM-Ester-Farbstoffen ist in den meisten Zellen 4-5 μM. Und die genaue Konzentration muss je nach experimentellen Anforderungen optimiert werden. Um eine durch Überladung bedingte Zytotoxizität zu vermeiden, wird empfohlen, die niedrigstmögliche Sondenkonzentration zu verwenden, die zu zufriedenstellenden Ergebnissen führt.
② (Optional) Falls die Zellen organische Anionentransporter enthalten, kann die Zugabe von Probenecid(GC16825, Probenecid, 1-2.5 mM) oder Sulfinpyrazon(GC11049, Sulfinpyrazone, 0.1-0.25 mM) zum Zellkulturmedium erforderlich sein, um die Leckage der Deesterifizierungssonde zu reduzieren. Die Stammlösungen von Probenecid oder Sulfinpyrazon sind alkalisch, deshalb muss der pH-Wert nach Zugabe des Kulturmediums angepasst werden.
③ Bei Verwendung von serumhaltigem Medium baut Serum-Lactonase AM ab und verringert dadurch die Farbstoffbeladung. Phenolrot-haltiges Medium führt hingegen zu einem leicht erhöhten Hintergrundwert. Es wird empfohlen, die Zellen vor Zugabe der Färbelösung 2- bis 3-mal zu waschen.
④ Durch senken der Temperatur beim Beladen der Sonde kann die Kompartimentierung der Sonde verringert werden.
(4) Nach der Inkubation 5 Minuten bei 1000 g zentrifugieren, um die Färbelösung zu entfernen. Dann PBS oder andere Puffer zugeben und 2-3 Mal waschen, um restliche Sonden zu entfernen.
(5) Weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die vollständige Deesterifizierung des intrazellulären AM sicherzustellen.
3. Zelladhäsionsfärbung
(1) Adhärente Zellen auf sterilen Deckgläsern kultivieren.
(2) Das Deckglas aus dem Kulturmedium entnehmen, überschüssiges Medium absaugen und das Deckglas in eine feuchte Umgebung legen.
(3) 100 μL Farbstofflösung von einer Ecke des Deckglases aus zu geben und vorsichtig schütteln, um alle Zellen gleichmäßig mit dem Farbstoff zu bedecken.
(4) 20 Minuten bis 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur oder darunter inkubieren. Die optimale Inkubationszeit variiert je nach Zelltyp; bitte entsprechend den jeweiligen experimentellen Anforderungen testen.
(5) Nach der Inkubation die Farbstofflösung verwerfen und das Deckglas 2- bis 3-mal mit PBS oder anderen Puffern waschen.
(6) 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Mikroskopische Detektion: Die maximale Anregungs-/Emissions-Wellenlänge von Fluo-3AM ist 488/526 nm.
Vorsichtsmaßnahmen:
1) Alle fluoreszierenden Farbstoffe haben Probleme mit der Quenching. Vermeiden Sie deshalb möglichst viel Licht, um die Fluoreszenzlöschung zu verlangsamen.
2) Tragen Sie zu Ihrer eigenen Sicherheit und Gesundheit einen Laborkittel und Einweghandschuhe.
| Cas No. | 121714-22-5 | SDF | |
| Überlieferungen | Fluo-3 Acetoxymethyl ester | ||
| Canonical SMILES | ClC(C=C1C(C2=CC(OCCOC(C=C(C)C=C3)=C3N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)=C(N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)C=C2)=C(C=C4Cl)C5=CC4=O)=C(C=C1O5)OCOC(C)=O | ||
| Formula | C51H50Cl2N2O23 | M.Wt | 1129.85 |
| Löslichkeit | Acetonitrile: 2 mg/ml,DMSO: 0.9 mg/ml | Storage | Store at -20°C,protect from light |
| General tips | Please select the appropriate solvent to prepare the stock solution according to the
solubility of the product in different solvents; once the solution is prepared, please store it in
separate packages to avoid product failure caused by repeated freezing and thawing.Storage method
and period of the stock solution: When stored at -80°C, please use it within 6 months; when stored
at -20°C, please use it within 1 month. To increase solubility, heat the tube to 37°C and then oscillate in an ultrasonic bath for some time. |
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| Shipping Condition | Evaluation sample solution: shipped with blue ice. All other sizes available: with RT, or with Blue Ice upon request. | ||
| Prepare stock solution | |||
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1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 885.1 μL | 4.4254 mL | 8.8507 mL |
| 5 mM | 177 μL | 885.1 μL | 1.7701 mL |
| 10 mM | 88.5 μL | 442.5 μL | 885.1 μL |
Step 1: Enter information below (Recommended: An additional animal making an allowance for loss during the experiment)
g
μL
Step 2: Enter the in vivo formulation (This is only the calculator, not formulation. Please contact us first if there is no in vivo formulation at the solubility Section.)
Calculation results:
Working concentration: mg/ml;
Method for preparing DMSO master liquid: mg drug pre-dissolved in μL DMSO ( Master liquid concentration mg/mL, Please contact us first if the concentration exceeds the DMSO solubility of the batch of drug. )
Method for preparing in vivo formulation: Take μL DMSO master liquid, next addμL PEG300, mix and clarify, next addμL Tween 80, mix and clarify, next add μL saline, mix and clarify.
Method for preparing in vivo formulation: Take μL DMSO master liquid, next add μL Corn oil, mix and clarify.
Note: 1. Please make sure the liquid is clear before adding the next solvent.
2. Be sure to add the solvent(s) in order. You must ensure that the solution obtained, in the previous addition, is a clear solution before proceeding to add the next solvent. Physical methods such as vortex, ultrasound or hot water bath can be used to aid dissolving.
3. All of the above co-solvents are available for purchase on the GlpBio website.
Quality Control & SDS
- View current batch:
- Purity: >95.00% Appearance: A solid
- COA (Certificate of Analysis)
- SDS (Safety Data Sheet)
- Datasheet
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