DMPO (Synonyms: 5,5Dimethyl1PyrrolineNOxide)

Ce plan fournit uniquement un guide, veuillez le modifier pour répondre à vos besoins spécifiques.

1. Préparation de la solution

(1) Solution de travail : Dissoudre le DMPO dans un tampon expérimental pour obtenir une concentration finale de 1 M. Utiliser un filtre à membrane de 0,22 µm pour filtrer la solution.

Remarque: Ajustez la concentration optimale de travail en fonction de la situation réelle ou référez-vous à la littérature pour définir une concentration en gradient. La solution de travail doit être préparée et utilisée immédiatement.

2. Détection in vivo des radicaux libres oxygénés avec DMPO [1, 2] (d'après la littérature, à titre de référence uniquement)

(1) Induire une anesthésie intrapéritonéale avec du pentobarbital de sodium (5 mg). Retirer le cœur, connecter une canule à l'aorte ascendante et perfuser avec du tampon Krebs-Henseleit à un débit constant (2 mL/min).

(2) Après l'ischémie, dissoudre le DMPO dans un tampon contenant 100 µM d'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DTPA) pour obtenir une concentration finale de 1 M. Immédiatement lors de la reperfusion, injecter le piégeur à un débit de 100 µL/min via le bras latéral proche du cœur.

(3) Pendant la reperfusion, collecter régulièrement l'effluent jusqu'à 5 minutes de reperfusion à des intervalles de temps spécifiés. Après avoir collecté les échantillons, congeler chaque tube immédiatement dans de l'azote liquide.

(4) Utiliser un spectromètre pour détecter et enregistrer le signal des radicaux libres oxygénés capturés par le DMPO.

3. Détection in vitro des radicaux hydroxyles avec DMPO [3] (d'après la littérature, à titre de référence uniquement)

(1) Ajouter différentes concentrations de solution de Fe₃O₄ à 1 mL d'échantillon. Ajouter 10 µL de solution de travail de DMPO à chaque échantillon en tant que capteur de radicaux libres. Incuber l'échantillon à 37°C pendant 6 heures pour assurer que la réaction soit complète. Ajouter 10 µL de solution de travail de DMPO à 1 mL de PBS comme groupe témoin.

(2) Filtrer le mélange réactionnel à l'aide d'un filtre de 0,22 µm pour éliminer les résidus solides et les grosses particules.

(3) Utiliser un spectromètre pour détecter et enregistrer le signal des radicaux hydroxyles capturés par le DMPO.

Remarque: Ce protocole fournit des indications pour la détection des radicaux libres centrés sur l'oxygène en utilisant le DMPO in vivo et in vitro. Il peut être ajusté en fonction d'autres publications et des exigences expérimentales spécifiques.

Références :

[1] West M B, Rokosh G, Obal D, et al. Cardiac myocyte–specific expression of inducible nitric oxide synthase protects against ischemia/reperfusion injury by preventing mitochondrial permeability transition[J]. Circulation, 2008, 118(19): 1970-1978.

[2] Wang P, Chen H, Qin H, et al. Overexpression of human copper, zinc-superoxide dismutase (SOD1) prevents postischemic injury[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95(8): 4556-4560.

[3] Qin X, Wu C, Niu D, et al. Peroxisome inspired hybrid enzyme nanogels for chemodynamic and photodynamic therapy[J]. Nature Communications, 2021, 12(1): 5243.