DDAO

このプランはあくまでもガイドであり、ご自分のニーズに合わせてご調整願います。

1.溶液の調製

(1)貯蔵液：DMSOにDDAOを溶解し、濃度が5mMの貯蔵液を調製する。

注：未使用の貯蔵液を小分けした後、暗所で-20℃または-80℃で保存し、繰り返した冷凍と解凍を避ける。

(2)作業溶液：正式な実験の前に、適切な緩衝液（例えば無血清培地またはPBS）で貯蔵液を、1μMなどの需要の作業濃度まで希釈する。

注：実際の条件に応じて、最適の作業濃度を調整するか、またはご自分で文献を参照して勾配濃度を設置してください。作業溶液は調製後ただちに使用するべき。

2.DDAOを使い、癌細胞におけるマクロファージの貪食作用^[1]（文献から作成、参考まで）

(1)0.8×10⁶ RAW264.5細胞または1×10⁶ THP1細胞を6ウェルのプレートに播種した。

(2)24時間培養した後、RAW264.7を0.1μg/mLのリポ多糖類（LPS）で24時間処理し、活性化させた。THP1細胞を40nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)で48時間処理し、分離させた。

(3)活性化されたマクロファージを、最終濃度が40nMのDiO (Cat. No. GC19515)で培地で20分間染色し、その後、培地で三回濯いだ。

(4)37℃で、PBSで1μM DDAO (5mMの貯蔵液、DMSO、−20°Cに保存)を癌細胞を15分間標識し、その後1%のFBSを含むPBSで洗浄した。

(5)DDAO標識の標的細胞(1×10⁶)をDiO染色のマクロファージ(Mφ)に添加し、2mLの最終量で37℃で2時間培養した。

(6)培養後、EDTA-PBSと三回洗浄し、Mφと標的細胞を採取し、0.25%のトリプシンで消化した。

(7)フローサイトメトリーを使い、成熟したMφに取り込まれた癌細胞を表す二重標識の細胞（DIO⁺/DDAO⁺）を評価した。

3.DDAOを使ってB細胞の増殖を研究する^[2]（文献より作成、参考まで）

(1)B細胞を1μM DDAOで標識し、4μg/mL CD40L, 100ng/mL BAFF, 1μg/mL 抗-IgMまたは2.5μg/mL CpGを添加された完全RPMI培地に培養した。

(2)3日間の培養の後、DDAO希釈（CRISPR標識のB細胞におけるmCherryの発見）をフローサイトメトリーで測定した。

References:

[1] Candas-Green D, Xie B, Huang J, et al. Dual blockade of CD47 and HER2 eliminates radioresistant breast cancer cells[J]. Nature communications, 2020, 11(1): 4591.

[2]Malinova D, Wasim L, Newman R, et al. Endophilin A2 regulates B?cell endocytosis and is required for germinal center and humoral responses[J]. EMBO reports, 2021, 22(9): e51328.