Driselase

Protokoll zur enzymatischen Hydrolyse von Grüntee-Rückständen mit Driselase^[1]:

1.Grüntee-Pulver(4 g) wurde mit 500 ml heißem Wasser und dann dreimal mit je 100 ml 70%igem Ethanol extrahiert.

2.Der Rückstand wurde mit Driselase (1 g), Pektinase und Proteasen in 100 ml 0.1 M Acetatpuffer(pH 5.5) 24 Stunden bei 37℃ verdaut.

3.Der Verdauansatz wurde mit absolutem Ethanol auf 70% aufgefüllt und die unlöslichen Bestandteile durch Filtration entfernt.

Protokoll zur detaillierten Protoplasten-Isolierung aus Hornmoosgewebe^[2]:

1.Das Hornmoosgewebe wird in 12 mL 0.5 M Mannitol in einer Petrischale auf einem Schüttler bei 100 rpm für 30 Minuten inkubiert. In der Zwischenzeit wird die Driselase (0.04 g/mL) in 0.5 M Mannitol-Lösung vorbereitet, 30 Minuten auf einem Schüttler inkubiert, 1 Minute bei 3500 rpm zentrifugiert und sterilfiltriert.

2.4 mL der Driselase-Lösung(Endkonzentration 1% w/v) werden zum Hornmoosgewebe gegeben und die Petrischalen abgedeckt, um während der Inkubation auf dem Schüttler für 10-12 Stunden Lichteinfall zu vermeiden.

3.Die Protoplasten müssen in den folgenden Schritten vorsichtig behandelt werden. Und das Pipettieren sollte langsam erfolgen, da die Protoplasten empfindlich gegenüber mechanischer Beschädigung sind.

4.Verwenden Sie eine 1mL-Pipettenspitze, deren Spitze entfernt wurde(ca. 2 mm vom Ende abgeschnitten), oder eine Glaspipette mit weitem Hals. Pipettieren Sie die Protoplastenlösung durch ein 70µm-Sieb in ein 50mL-Falcon-Röhrchen, dadurch dass Sie die Pipettenspitze auf das Sieb aufsetzen, anstatt die Lösung hindurchzuspritzen. Waschen Sie die Petrischale zweimal mit je 3 ml 0.5 M Mannitol, dadurch dass Sie die Petrischale kippen und sie bei jedem Waschgang 3-4 Mal spülen.

5.Teilen Sie das Filtrat(je ca. 10 mL, gegebenfalls mit 0.5 M Mannitol auffüllen) in zwei Glasröhrchen mit Schraubverschluss auf und zentrifugieren Sie diese 15 Minuten lang bei niedriger Drehzahl(600 rpm, Beschleunigung 3, Bremsung 3), um die Protoplasten nicht zu beschädigen.

6.Den Überstand verwerfen und jedes Pellet vorsichtig in 10 mL 0.5 M Mannitol resuspendieren, dadurch dass die Lösung vorsichtig an der Innenwand des Röhrchens entlangläuft. Das Röhrchen langsam um 40° neigen und dann vorsichtig in der Handfläche rollen, bis alle Protoplasten resuspendiert sind und keine Klumpen mehr bilden.

7.Die Röhrchen 15 Minuten bei 600 rpm zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Dann jedes Pellet vorsichtig in 5 mL 0.5 M Mannitol resuspendieren und die Proben beider Röhrchen zusammenführen, entweder mithilfe abgeschnittener Pipettenspitzen oder indem die Probe langsam von einem Röhrchen in das andere fließt.

8.Die Anzahl der Protoplasten mithilfe einer Zählkammer bestimmen und dann 15 Minuten bei 600 rpm zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Protoplasten resuspendieren.

Protokoll für die Protoplastierung aus F. verticillioides strain 3693^[3]:

1.Kultur- und Wachstumsbedingungen

(1) F. verticillioides strain 3693 wurde routinemäßig auf Vollmedium(CM) kultiviert. Zur Konidienbildung wurde die Myzelkultur auf Carboxymethylcellulose-Medium(CMC) beimpft und 2 Wochen bei 26℃ inkubiert.

1.Herstellung des Protoplastierungsmediums

(1) Das Protoplastierungsmedium besteht aus Zellwandabbauenden Enzymen und einem osmotischen Stabilisator.

(2) Alle lyophilisierten Enzympulver außer Driselase wurden zunächst in geeignetem Protoplastierungsmedium gelöst. Die Arbeitsstammlösung des Driselase-Enzyms wurde durch 30-minütiges Rühren mit einem Magnetrührer hergestellt. Dann wurde die Enzymlösung durch einen 0.2-Mikron-Filter filtriert, um ungelöste Rückstände zu entfernen. 0.5 ml der filtrierten Driselase-Lösung wurden in ein Reagenzglas gegeben und mit 0.5 ml osmotischem Stabilisator versetzt, sodass das resultierende 1 ml Protoplastierungsmedium eine Konzentration von 1:1 an osmotischem Stabilisator und 1:1 an Driselase enthielt.

(3) Eine Stammlösung des Lyseenzyms wurde in Wasser 20-facher Konzentration hergestellt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die benötigte Menge des Lyseenzyms wurde mit der benötigten Menge an osmotischen Stabilisator vermischt, um das Protoplastierungsmedium herzustellen.

(4) β-glucuronidase wurde mit 200 Einheiten/ml dem Protoplastierungsmedium zugesetzt. Verschiedene osmotische Substanzen wie KCl, MgSO₄, NaCl, Sorbitol und Saccharose wurden als osmotische Stabilisatoren im Protoplastierungsmedium verwendet. Sie wurden in verschiedenen Konzentrationen hergestellt(0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.2 M, 1.4 M usw.). Die Salze wurden in der gewünschten Konzentration in Wasser gelöst, der pH-Wert auf 5.6 bis 5.8 eingestellt und die Lösungen autoklaviert. Jede Behandlung wurde dreifach wiederholt, und das Experiment wurde insgesamt dreimal durchgeführt.

1.Protoplastierungspräparation

(1) Ein ml Konidien von F. verticillioides(10⁹ Konidien/ml) wurde in 100 ml YPD-Medium inokuliert und bei 28℃ und 250 rpm inkubiert.

(2) Zur Gewinnung verschiedener Wachstumsstadien von Pilzen, wie z.B. gekeimte Konidien(2-10 μm lange Ausstülpungen der Konidien), Keimschläuche(50-100 μm lange Keimschläuche der Konidien) und gut entwickelte Myzelien(Keimschläuche mit einer Länge von über 200 μm und zwei bis drei verzweigten Myzelien), für die Protoplastierung wurden die in YPD-Medium inokulierten Konidien jeweils 8, 12 und 24 Stunden nach der Inokulation inkubiert.

(3) Die gekeimten Konidien, Keimschläuche und Myzelien wurden mit Miracloth gesammelt und das anhaftende Restmedium durch dreimaliges Waschen mit sterilem Wasser entfernt. Das Myzel wurde entweder für die Protoplastierung verwendet oder eine Woche lang bei 4℃ gelagert.

(4) 25 mg Pilzmaterial pro ml Protoplastierungsmedium wurden in ein Reagenzglas gegeben. Das Pilzmaterial wurde durch leichtes Vortexen gut mit dem Protoplastierungsmedium vermischt und für verschiedene Zeiträume bei 30℃ und 100 rpm inkubiert. Die Protoplasten wurden mithilfe einer Zählkammer gezählt.

Das Protokoll dient nur als Richtlinie und sollte an Ihre spezifischen Bedürfnisse angepasst werden.

References:

[1].  Katsuno Y, Koyama Y, et,al. Apoptosis-inducing activity of a driselase digest fraction of green tea residue. Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Jan;65(1):198-201. doi: 10.1271/bbb.65.198. PMID: 11272830.

[2]. Neubauer A, Ruaud S, et,al.Step-by-step protocol for the isolation and transient transformation of hornwort protoplasts. Appl Plant Sci. 2022 Feb 11;10(2):e11456. doi: 10.1002/aps3.11456. PMID: 35495192; PMCID: PMC9039799.

[3].Ramamoorthy V, Govindaraj L, et,al. Combination of driselase and lysing enzyme in one molar potassium chloride is effective for the production of protoplasts from germinated conidia of Fusarium verticillioides. J Microbiol Methods. 2015 Apr;111:127-34. doi: 10.1016/j.mimet.2015.02.010. Epub 2015 Feb 24. PMID: 25724844.